熒光素酶報告基因

一、應用原理

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。

其原理簡述如下：

（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

二、技術流程

（1） 用生物信息學方法分析并預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點。

（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質粒備用。

（4） 擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。

（5） 培養293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。